کروماتوگرافی مایع یا HPLC یکی از روش‌های کروماتوگرافی برای جداسازی مواد است. در این روش، یک حلال مایع تحت فشار، حاوی مخلوط نمونه، از ستونی پر شده با ماده جاذب جامد عبور می‌کند. مواد مختلف در نمونه بر اساس برهم‌کنش با ماده جاذب جامد، با سرعت‌های مختلفی از ستون خارج می‌شوند و با استفاده از آشکارساز، جدا شده و شناسایی می‌شوند
به طور خلاصه، کروماتوگرافی مایع یک روش جداسازی مواد بر اساس برهم‌کنش آن‌ها با ماده جاذب جامد در یک حلال مایع تحت فشار است. این روش در بسیاری از زمینه‌های علمی و صنعتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
کاربرد کروماتوگرافی مایع
کاربردهای کروماتوگرافی مایع (HPLC) بسیار گسترده هستند و در بسیاری از زمینه‌های علمی و صنعتی مورد استفاده قرار می‌گیرند. برخی از کاربردهای این روش عبارتند از:
تعیین و شناسایی ترکیبات شیمیایی در نمونه‌های مختلف، از جمله داروها، مواد غذایی، نمونه‌های بیولوژیکی و غیره.
کنترل کیفیت محصولات صنعتی، از جمله داروها، مواد شیمیایی، مواد غذایی و غیره.
تعیین غلظت و میزان مواد مختلف در نمونه‌های مختلف، از جمله داروها، مواد غذایی، نمونه‌های بیولوژیکی و غیره.
خواص فیزیکی و شیمیایی مواد مختلف، از جمله داروها، مواد شیمیایی، مواد غذایی و غیره.
تعیین ساختار مولکولی مواد مختلف، از جمله داروها، مواد شیمیایی، مواد غذایی و غیره.
به طور خلاصه، کروماتوگرافی مایع یک روش جداسازی مواد است که در بسیاری از زمینه‌های علمی و صنعتی مورد استفاده قرار می‌گیرد. کاربردهای این روش شامل تعیین و شناسایی ترکیبات شیمیایی، کنترل کیفیت محصولات صنعتی، تعیین غلظت و میزان مواد مختلف، تعیین خواص فیزیکی و شیمیایی مواد مختلف و تعیین ساختار مولکولی مواد مختلف می‌شود.
تفاوت کروماتوگرافی مایع و گازی در چیست ؟
کروماتوگرافی مایع و کروماتوگرافی گازی دو روش متفاوت برای جداسازی مواد هستند. تفاوت‌های اصلی بین این دو روش عبارتند از:
فاز متحرک: در کروماتوگرافی مایع، فاز متحرک یک مایع است، در حالی که در کروماتوگرافی گازی، فاز متحرک یک گاز است.
فاز ساکن: در کروماتوگرافی مایع، فاز ساکن معمولاً یک جامد یا یک مایع است، در حالی که در کروماتوگرافی گازی، فاز ساکن معمولاً یک جامد است.
فشار: در کروماتوگرافی مایع، فشار بیشتری نسبت به کروماتوگرافی گازی است.
قابلیت جداسازی: کروماتوگرافی مایع برای جداسازی مواد با ویژگی‌های شیمیایی مشابه مفید است، در حالی که کروماتوگرافی گازی برای جداسازی مواد با ویژگی‌های فیزیکی مشابه مفید است.
به طور خلاصه، کروماتوگرافی مایع و کروماتوگرافی گازی دو روش متفاوت برای جداسازی مواد هستند که در هر یک از این روش‌ها، فاز متحرک و فاز ساکن به صورت متفاوتی تعریف شده‌اند و برای جداسازی مواد با ویژگی‌های مختلف استفاده می‌شوند.
اجزای تشکیل دهنده دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
دستگاه کروماتوگرافی مایع شامل اجزای مختلفی است که هر کدام نقش وظیفه‌ای خاص در جداسازی مواد دارند. برخی از اجزای اصلی دستگاه کروماتوگرافی مایع عبارتند از:
ستون:
ستون دستگاه کروماتوگرافی مایع یک قطعه مهم در این دستگاه است که برای جداسازی مواد مورد استفاده قرار می‌گیرد. ستون در دستگاه کروماتوگرافی مایع معمولاً یک لوله بلند و باریک است که دارای فاز ساکن است. فاز ساکن می‌تواند یک جامد یا یک مایع باشد که برای جداسازی مواد از هم استفاده می‌شود. در داخل ستون، فاز متحرک به صورت یک مایع عبور می‌کند و با توجه به خواص فیزیکی و شیمیایی مواد، مواد مختلف از هم جدا می‌شوند. ستون‌های کروماتوگرافی مایع با انواع مختلف فاز ساکن و فاز متحرک در بازار موجود هستند که برای جداسازی مواد با ویژگی‌های مختلف استفاده می‌شوند.
انتخاب ستون دستگاه HPLC
برای انتخاب ستون کروماتوگرافی مایع، می‌توان به روش‌های زیر توجه کرد:
نوع فاز ساکن: برای انتخاب ستون کروماتوگرافی مایع، باید نوع فاز ساکن را مشخص کرد. فاز ساکن می‌تواند یک جامد یا یک مایع باشد و باید با توجه به خواص فیزیکی و شیمیایی مواد، فاز ساکن مناسب را انتخاب کرد.
طول ستون: طول ستون نیز باید با توجه به نوع نمونه و مواد مورد جداسازی تعیین شود. ستون‌های بلندتر برای جداسازی مواد با ویژگی‌های شیمیایی مشابه مناسب هستند.
قطر داخلی : قطر داخلی ستون نیز باید با توجه به نوع نمونه و مواد مورد جداسازی تعیین شود. ستون‌های با قطر کوچکتر برای جداسازی مواد با ویژگی‌های شیمیایی مشابه مناسب هستند.
نوع فاز متحرک: نوع فاز متحرک نیز باید با توجه به نوع نمونه و مواد مورد جداسازی تعیین شود. فاز متحرک می‌تواند یک مایع باشد که باید با توجه به خواص فیزیکی و شیمیایی مواد، فاز متحرک مناسب را انتخاب کرد.
کارایی ستون کروماتوگرافی مایع : کارایی ستون نیز باید در انتخاب ستون کروماتوگرافی مایع مورد توجه قرار گیرد. کارایی ستون به میزان جداسازی مواد از هم بستگی دارد و باید ستونی با کارایی مناسب را انتخاب کرد.
به طور خلاصه، برای انتخاب ستون کروماتوگرافی مایع، باید به نوع فاز ساکن، طول ستون، قطر داخلی ستون، نوع فاز متحرک و کارایی ستون توجه کرد.
پمپ: پمپ در دستگاه کروماتوگرافی مایع برای تزریق فاز متحرک به ستون و تنظیم جریان فاز متحرک استفاده می‌شود. پمپ‌ها معمولاً قابلیت تنظیم دقیق جریان را دارند
. پمپ در این دستگاه، وظیفه حرکت دادن فاز متحرک با یک نرخ جریانی مشخص بر حسب میلی‌لیتر بر دقیقه را دارد. همچنین پمپ باعث می‌شود نمونه با فشار (حدود 40 مگا پاسکال و یا بیشتر) به سمت ستون کروماتوگرافی جابجا شود
. در دستگاه HPLC، از ستون کروماتوگرافی، فاز ساکن، فاز متحرک، پمپ، انژکتور، آشکارساز، سلول جریانی و نرم‌افزار کنترل استفاده می‌شود
دتکتور:
دتکتور در دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC، وظیفه تشخیص و اندازه‌گیری غلظت ترکیبات جدا شده در جریان خروجی از ستون کروماتوگرافی را دارد. انواع دتکتورهای استفاده شده در دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC عبارتند از
آشکارساز UV-Vis:
آشکارساز UV-Vis یکی از رایج‌ترین آشکارسازهای HPLC است که جز آشکارسازهای جذبی هستند و حساسیت خوبی برای ترکیبات جاذب نور دارند. در هنگام آنالیز، نمونه وارد یک سلول شیشه‌ای بی رنگ به نام Flow cell می‌شود. هنگامی که نور UV بر سلول جریان تابش می‌شود، نمونه بخشی از نور UV را جذب می‌کند. شدت نور UV برای فاز متحرک بدون نمونه (شاهد) و حاوی نمونه متفاوت خواهد بود. با اندازه‌گیری این تفاوت، مقدار نمونه تعیین می‌شود
آشکارساز فلورسانس:
آشکارساز فلورسانس یکی از دتکتورهای HPLC است که برای تشخیص ترکیبات فلورسانت استفاده می‌شود. در این دتکتور، نمونه با استفاده از یک لامپ UV به طول موج یازده‌صد نانومتر تابش می‌شود. سپس ترکیبات فلورسانت در نمونه، نور را با طول موج بلندتری (بیشتر از یازده‌صد نانومتر) تابش می‌دهند. این نور سپس توسط یک لامپ فلورسانت دریافت می‌شود و به یک دتکتور فلورسانت منتقل می‌شود. با توجه به میزان نور دریافتی، می‌توان غلظت ترکیبات فلورسانت را اندازه‌گیری کرد
آشکارساز RI:
آشکارساز RI یکی از دتکتورهای HPLC است که بر اساس تغییر در شاخص شکست نور توسط ترکیبات موجود در جریان خروجی از ستون کار می‌کند. در این دتکتور، نور از یک منبع نوری به سمت سلول RI هدایت می‌شود. سلول RI دارای دو بخش است که یکی از آن‌ها با فاز متحرک و دیگری با فاز ساکن پر شده است. با عبور نمونه از ستون کروماتوگرافی، شاخص شکست نور در سلول RI تغییر می‌کند و این تغییر باعث تولید سیگنال خروجی می‌شود. با توجه به شدت سیگنال خروجی، می‌توان غلظت ترکیبات موجود در نمونه را اندازه‌گیری کرد
آشکارساز CD:
آشکارساز CD یکی از دتکتورهای HPLC است که برای تشخیص ترکیبات حاوی اجزای یونی کاربرد دارد. در این دتکتور، نمونه با استفاده از یک ستون کروماتوگرافی یونی به جداسازی ترکیبات با اجزای یونی می‌پردازد. در این روش، ترکیبات با اجزای یونی در حضور یک میدان مغناطیسی، به دور از محلول تحت تأثیر قرار می‌گیرند و باعث تغییر در شدت نور می‌شوند. با توجه به شدت سیگنال خروجی، می‌توان غلظت ترکیبات موجود در نمونه را اندازه‌گیری کرد
آشکارساز OR:
آشکارساز OR یکی از دتکتورهای HPLC است که برای اندازه‌گیری ترکیبات دارای ایزومر نوری استفاده می‌شود. در این دتکتور، نمونه با استفاده از یک ستون کروماتوگرافی کریستالوگرافی به جداسازی ترکیبات با ایزومر نوری می‌پردازد. در این روش، ترکیبات با ایزومر نوری در حضور یک میدان مغناطیسی، به دور از محلول تحت تأثیر قرار می‌گیرند و باعث تغییر در شدت نور می‌شوند. با توجه به شدت سیگنال خروجی، می‌توان غلظت ترکیبات موجود در نمونه را اندازه‌گیری کرد
آشکارساز رزونانس مغناطیس هسته:
آشکارساز رزونانس مغناطیس هسته (NMR) یکی از دتکتورهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC نیست. این دتکتور برای تشخیص و تعیین ساختار ترکیبات مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این روش، نمونه با استفاده از یک میدان مغناطیسی قوی، به دور از محلول تحت تأثیر قرار می‌گیرد و باعث تولید سیگنال خروجی می‌شود. با توجه به شدت سیگنال خروجی، می‌توان ساختار ترکیبات موجود در نمونه را تعیین کرد
هر یک از این دتکتورها برای تشخیص و اندازه‌گیری ترکیبات با خصوصیات مختلف استفاده می‌شوند.
سیستم تزریق:
سیستم تزریق برای وارد کردن نمونه‌ها به ستون استفاده می‌شود. این سیستم معمولاً شامل سرنگ تزریق و واحد تزریق است.
کنترلر دما:
برای تنظیم و کنترل دمای ستون و فاز متحرک از کنترلر دما استفاده می‌شود. این اجزا به دستگاه کمک می‌کنند تا دمای مورد نیاز برای جداسازی مواد را حفظ کند.
سیستم جمع‌آوری نتایج:
این سیستم برای جمع‌آوری و ثبت نتایج جداسازی مواد استفاده می‌شود. این شامل نرم‌افزارها و دستگاه‌های ضبط داده می‌شود.
همچنین، دستگاه کروماتوگرافی مایع ممکن است شامل سایر اجزا مانند پیش‌تیماردهنده‌ها، فیلترها، کلمپ‌ها و شیرها نیز باشد که برای بهبود عملکرد و استفاده بهینه از دستگاه استفاده می‌شوند.
نحوه تزریق نمونه در کروماتوگرافی مایع
نمونه‌ها در کروماتوگرافی مایع با کمک یک سرنگ تزریق می‌شوند. حجم نمونه توسط سرنگ اندازه‌گیری و تزریق می‌شود و به راحتی می‌توان حجم تزریقی را تنظیم کرد. پس از تزریق نمونه، حلال مایع به عنوان فاز متحرک، از طریق یک پمپ، در طول ستون عبور می‌کند و مواد مختلف در نمونه بر اساس برهم‌کنش با فاز جامد، با سرعت‌های مختلفی از ستون خارج می‌شوند و با استفاده از آشکارساز، جدا شده و شناسایی می‌شوند
تنظیم فشار در HPLC
برای تنظیم فشار در دستگاه کروماتوگرافی مایع، از پارامترهایی مانند سرعت جریان فاز متحرک و قطر ستون استفاده می‌شود. با تغییر این پارامترها، می‌توان فشار را تنظیم کرد. برای تنظیم سرعت جریان فاز متحرک، از یک پمپ استفاده می‌شود که میزان جریان فاز متحرک را تنظیم می‌کند. همچنین، با تغییر قطر ستون، میزان مقاومت در برابر جریان فاز متحرک تغییر می‌کند و بنابراین فشار نیز تغییر می‌کند.
در دستگاه کروماتوگرافی مایع، تنظیم فشار به صورت دقیق و کنترل شده انجام می‌شود. این کنترل فشار می‌تواند به صورت دستی توسط کاربر یا به صورت خودکار توسط سیستم دستگاه انجام شود. در برخی از دستگاه‌های HPLC، فشار به صورت خودکار تنظیم می‌شود تا بهترین شرایط جداسازی برای نمونه‌ها فراهم شود.
به طور خلاصه، فشار در دستگاه کروماتوگرافی مایع با تغییر پارامترهایی مانند سرعت جریان فاز متحرک و قطر ستون تنظیم می‌شود. این تنظیم می‌تواند به صورت دستی توسط کاربر یا به صورت خودکار توسط سیستم دستگاه انجام شود.
بهینه سازی فشار در دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
برای بهینه‌سازی فشار در دستگاه کروماتوگرافی مایع، می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:
تنظیم سرعت جریان فاز متحرک
با افزایش سرعت جریان فاز متحرک، فشار در دستگاه افزایش می‌یابد. با این حال، باید توجه داشت که افزایش سرعت جریان فاز متحرک ممکن است باعث کاهش جداسازی مواد شود.
برای تنظیم سرعت جریان فاز متحرک در دستگاه کروماتوگرافی مایع، می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:
تنظیم سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از پمپ: سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از پمپ تنظیم می‌شود. این پمپ میزان جریان فاز متحرک را تنظیم می‌کند و باید به گونه‌ای باشد که فاز متحرک به طور یکنواخت از ستون عبور کند.
تنظیم سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از قطر: با افزایش قطر ستون، میزان جریان فاز متحرک افزایش می‌یابد و برعکس، با کاهش قطر ستون، میزان جریان فاز متحرک کاهش می‌یابد.
تنظیم سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از نوع فاز متحرک: نوع فاز متحرک می‌تواند بر سرعت جریان فاز متحرک تأثیر بگذارد. برای مثال، استفاده از فاز متحرک با فشار بالا می‌تواند باعث افزایش سرعت جریان فاز متحرک شود.
تنظیم سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از دمای فاز متحرک: با افزایش دمای فاز متحرک، میزان جریان فاز متحرک افزایش می‌یابد و برعکس، با کاهش دمای فاز متحرک، میزان جریان فاز متحرک کاهش می‌یابد.
به طور خلاصه، برای تنظیم سرعت جریان فاز متحرک در دستگاه کروماتوگرافی مایع، می‌توان از روش‌هایی مانند تنظیم سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از پمپ، تنظیم سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از قطر ستون، تنظیم سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از نوع فاز متحرک و تنظیم سرعت جریان فاز متحرک با استفاده از دمای فاز متحرک استفاده کرد.
تنظیم قطر ستون:
با افزایش قطر ستون، فشار در دستگاه کاهش می‌یابد. با این حال، باید توجه داشت که افزایش قطر ستون ممکن است باعث کاهش دقت جداسازی مواد شود.
برای تنظیم قطر ستون در دستگاه کروماتوگرافی مایع، می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:
تغییر قطر: با افزایش قطر ستون، میزان جریان فاز متحرک افزایش می‌یابد و برعکس، با کاهش قطر ستون، میزان جریان فاز متحرک کاهش می‌یابد. بنابراین، با تغییر قطر ستون می‌توان فشار را نیز تنظیم کرد.
انتخاب ستون مناسب: برای تنظیم قطر ستون، باید ستون مناسبی را انتخاب کرد. ستون‌های با قطر کوچکتر، جداسازی بهتری را ارائه می‌دهند، اما فشار بیشتری را نیز نیاز دارند. به علاوه، ستون‌های با قطر بزرگتر، فشار کمتری را نیاز دارند، اما جداسازی بهتری را ارائه نمی‌دهند.
تنظیم دما: با افزایش دمای ستون، جریان فاز متحرک افزایش می‌یابد و برعکس، با کاهش دمای ستون، جریان فاز متحرک کاهش می‌یابد. بنابراین، با تنظیم دمای ستون می‌توان قطر ستون را نیز تنظیم کرد.
به طور خلاصه، برای تنظیم قطر ستون در دستگاه کروماتوگرافی مایع، می‌توان از روش‌هایی مانند تغییر قطر ستون، انتخاب ستون مناسب و تنظیم دمای ستون استفاده کرد.
استفاده از فاز متحرک با فشار بالا:
استفاده از فاز متحرک با فشار بالا می‌تواند باعث بهبود جداسازی مواد در کروماتوگرافی مایع شود. در این روش، فاز متحرک با فشار بالا به ستون تزریق می‌شود و باعث افزایش جریان فاز متحرک در ستون می‌شود. این روش به خصوص برای جداسازی ترکیبات با ویژگی‌های شیمیایی مشابه مفید است. با این حال، باید توجه داشت که استفاده از فاز متحرک با فشار بالا ممکن است باعث کاهش دقت جداسازی شود و همچنین نیاز به دستگاه‌های خاصی برای تزریق فاز متحرک با فشار بالا دارد
استفاده از ستون با دیامتر داخلی بزرگ:
استفاده از ستون با دیامتر داخلی بزرگ می‌تواند باعث کاهش فشار در دستگاه کروماتوگرافی مایع شود. با افزایش قطر داخلی ستون، میزان جریان فاز متحرک افزایش می‌یابد و بنابراین فشار در دستگاه کاهش می‌یابد. با این حال، باید توجه داشت که استفاده از ستون با دیامتر داخلی بزرگ ممکن است باعث کاهش دقت جداسازی شود و همچنین زمان جداسازی نیز افزایش می‌یابد. بنابراین، برای استفاده از ستون با دیامتر داخلی بزرگ، باید به دقت تعیین کنید که آیا این روش برای نمونه خاص شما مناسب است یا خیر.
تنظیم دمای فاز متحرک:
با افزایش دمای فاز متحرک، فشار در دستگاه کاهش می‌یابد. با این حال، باید توجه داشت که افزایش دمای فاز متحرک ممکن است باعث کاهش جداسازی مواد شود.
برای تنظیم دمای فاز متحرک در دستگاه کروماتوگرافی مایع، می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:
تنظیم دمای فاز متحرک با استفاده از یک کنترل کننده دما: با استفاده از یک کنترل کننده دما، می‌توان دمای فاز متحرک را تنظیم کرد. این کنترل کننده دما می‌تواند به صورت دستی یا خودکار باشد.
تنظیم دما:
با افزایش دمای ستون، جریان فاز متحرک افزایش می‌یابد و برعکس، با کاهش دمای ستون، جریان فاز متحرک کاهش می‌یابد. بنابراین، با تنظیم دمای ستون می‌توان دمای فاز متحرک را نیز تنظیم کرد.
استفاده از فاز متحرک با دمای پایین: استفاده از فاز متحرک با دمای پایین می‌تواند باعث بهبود جداسازی مواد شود.
به طور خلاصه، برای تنظیم دمای فاز متحرک در دستگاه کروماتوگرافی مایع، می‌توان از روش‌هایی مانند تنظیم دمای فاز متحرک با استفاده از یک کنترل کننده دما، تنظیم دمای ستون و استفاده از فاز متحرک با دمای پایین استفاده کرد.
به طور خلاصه، برای بهینه‌سازی فشار در دستگاه کروماتوگرافی مایع، می‌توان از روش‌هایی مانند تنظیم سرعت جریان فاز متحرک، تنظیم قطر ستون، استفاده از فاز متحرک با فشار بالا، استفاده از ستون با دیامتر داخلی بزرگ و تنظیم دمای فاز متحرک استفاده کرد.
